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干貨分享:T4 ELISA檢測試劑盒-競爭法

更新時間:2026-03-04      瀏覽次數(shù):317

T4 ELISA檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)主要采用競爭抑制 ELISA原理,用于定量檢測生物樣本中的甲狀腺素(T4),核心結(jié)論為:顏色深淺與樣本 T4 濃度成反比,在 450 nm 讀取吸光度,通過標準曲線計算濃度;主流規(guī)格為 48T/96T,2–8℃避光保存,多數(shù)產(chǎn)品僅供科研使用。

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檢測原理(競爭法)

  1. 包被:酶標板預(yù)包被 T4 半抗原或抗 T4 抗體。

  2. 競爭結(jié)合:加入樣本(含 T4)與標記抗原(如生物素化 T4),兩者競爭結(jié)合固相抗體;樣本 T4 濃度越高,標記抗原結(jié)合越少。

  3. 洗滌:去除未結(jié)合的游離成分。

  4. 顯色:加入酶標二抗 / 親和素(HRP 標記),與結(jié)合的標記抗原形成復(fù)合物;加 TMB 底物顯藍色。

  5. 終止與讀數(shù):加終止液變黃,450 nm 測 OD 值;OD 值與 T4 濃度負相關(guān)。

線性范圍:0.62-40 ng/mL

1. 預(yù)期用途

本試劑盒設(shè)計用于定量檢測血清、血漿、組織勻漿、細胞上清、細胞裂解物等樣本中的待測物濃度,僅供研究使用,不得用于醫(yī)學(xué)診斷。

2. 檢測原理 

試劑盒采用競爭法原理:將合成半抗原包被于酶標板上,同時加入樣品和抗體試劑(一抗),樣品中的待測物與半抗原上偶聯(lián)的待測物競爭結(jié)合抗體(一抗),結(jié)合形成“半抗原-抗體"免疫復(fù)合物,清洗去除游離的免疫復(fù)合物后,加入TMB顯色,樣本中待測物濃度越高藍色越淺,加入終止液,用酶標儀在450 nm處測OD值,顏色的深淺和樣品中的待測物含量呈反比,通過繪制標準曲線計算出樣本中待測物的濃度。

3. 包含的實驗材料實驗材料

Label

組成成分

Kit Components

數(shù)量(48T

Quantity

數(shù)量(96T

Quantity

酶標板

預(yù)包被半抗原的酶標板

6

8×12

校準品(10×

10倍濃縮校準品400 ng/mL

1×200μL

1×300μL

一抗抗體

即用型檢測抗體

1×3mL

1×6mL

酶標二抗

HRP標記二抗抗體

1×6mL

1×12mL

通用稀釋液(20×

樣品/校準品/一抗抗體通用稀釋液

1×10mL

1×15mL

濃縮洗液(20×

20倍濃縮洗液

1×15mL

1×25mL

顯色劑

TMB

1×6mL

1×10mL

終止液

稀硫酸

1×3mL

1×6mL

如需單獨采購通用型組分,請?zhí)峁?yīng)的組分名稱。

4. 需要但未包含的實驗材料

· 蒸餾水或去離子水,一次性離心管、一次性手套等耗材;

· 移液器、多通道移液器及配套槍頭;

· 燒杯、量筒、試劑瓶等容器具;

· 用于封貼微孔板的封板膜或其他替代材料;

· 微孔板振蕩器(如有需要)、離心機、旋渦振蕩器等輔助設(shè)備;

· 恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、酶標儀、洗板機。

5. 試劑的準備及儲存

· 1×洗液的配制:濃縮洗液(20×)如有晶體析出,需在37℃下加熱至晶體全部溶解后使用。用蒸餾水1:20稀釋,例如:10mL濃縮洗滌液加入190mL的蒸餾水,混合均勻。

· 1×通用稀釋液的配制:用蒸餾水1:20稀釋,例如:10mL20×濃縮通用稀釋液加入190mL的蒸餾水,混合均勻。

· 工作校準品的配制:校準品開封前應(yīng)離心30,確保所有校準品集中于底部;

準備7個離心管,將10×校準品按需吸取一定量用“通用稀釋液"稀釋10倍配制成校準品S1。例:50uL10×校準品+450uL的“通用稀釋液",制備得到500μLS1濃度校準品。在隨后的6個離心管中分別加入250μL的“通用稀釋液",在這6個試管中(S2~S7)將S1校準品依次倍比稀釋6個梯度至S7,共配制7個濃度的校準品,依次為:S1S2、S3、S4、S5S6S7,如下圖所示,“通用稀釋液"作為零濃度校準品S0,共8支校準品。

· image.png

6. 樣品采集、預(yù)處理及儲存

· 血清:使用血清采集管采集全血,室溫靜置待血細胞凝集后取的血清,或直接在1000×g下離心15分鐘取得血清。操作應(yīng)柔和,避免溶血發(fā)生。獲取的血清應(yīng)及時進行檢測,如不能及時進行檢測,應(yīng)等分為多份,儲存在-20℃及以下溫度條件,儲存時間不超過6個月,樣品凍融不超過2次。

· 血漿:使用EDTA或肝素采血管收集血漿。全血采集后以1000×g離心15分鐘取得血漿。操作應(yīng)柔和,避免溶血發(fā)生。獲取的血漿應(yīng)及時進行檢測,如不能及時進行檢測,應(yīng)等分為多份,儲存在-20℃及以下溫度條件,儲存時間不超過6個月,樣品凍融不超過2次。

· 組織:組織稱重后剪碎,將剪碎的組織加入裂解液,一般按1:4-1:9的重量體積比,比如100mg的組織樣品對應(yīng)400uL裂解液,具體可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整最后將勻漿液于5000×g離心5-10分鐘,取上清檢測。

· 細胞取適量細胞,于冰上進行超聲破碎,5000×g離心5-10分鐘,取上清檢測。

· 細胞上清取細胞上清5000×g離心5-10分鐘,取上清檢測。

 

 

 

 

7. 實驗步驟

使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右,也可置于37℃溫箱快速回溫至室溫。

注意:酶標板未恢復(fù)室溫前,請勿開封。

 

1

每孔加入校準品/待測樣品50μL,之后每孔再加入一抗抗體工作液50uL

2

蓋上封板膜,在37℃下孵育60分鐘。

3

洗板5次,最后一次洗板后棄去殘留洗液,倒扣酶標板,在干凈的吸水紙上拍干。

4

每孔加入100μL酶標二抗。

5

蓋上封板膜,在37℃下孵育30分鐘。

6

洗板5次,最后一次洗板后棄去殘留洗液,倒扣酶標板,在干凈的吸水紙上拍干。

7

每孔加入100μL顯色液

8

37℃下避光孵育15分鐘。

9

每孔加入50μL終止液。

10

使用酶標儀在450nm檢測波長及620~690nm參比波長條件下測定吸光度值,如果沒有參比波長則僅選擇450nm波長進行檢測。如果最高濃度校準品OD值過高,應(yīng)立即在405/630nm雙波長條件下檢測。

8.  結(jié)果計算

建議使用四參數(shù)邏輯(4-P)曲線擬合:以濃度值為橫坐標,吸光度值為縱坐標;

建議使用專業(yè)化軟件進行結(jié)果擬合和計算,如ELISA CALC、SPSS、Graphpad Prism等。示例數(shù)據(jù)

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考,實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標準曲線。

image.png 

9. 檢測的局限性

樣本濃度超出檢測范圍上,應(yīng)當進行適當加大稀釋倍數(shù)后再次檢測,計算結(jié)果應(yīng)當乘上稀釋倍數(shù)。樣本濃度低于LOQ定量,檢測結(jié)果無法進行準確定量。

 

10. 產(chǎn)品性能指標

以下結(jié)果基于校準品的濃度值實驗得出,未納入基質(zhì)效應(yīng)等其他因素的潛在影響。

靈敏度:0.38ng/mL。

精密度:板內(nèi)精密度CV10%N=20),板間精密度CV15%N=20)。

特異性(Analytical specificity):其他相關(guān)因子在稀釋緩沖液中制備為10μg/mL測定,沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。?


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